間接血凝實(shí)驗(yàn)的一般原理及一般步驟

      血凝試驗(yàn)（hemagglutinationtest）是紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的簡稱。間接血凝試驗(yàn)是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，以下簡述其操作過程。（一）載體紅細(xì)胞是大小均一的載體顆粒，最常用的為綿羊、家兔、雞的紅細(xì)胞及O型人紅細(xì)胞。新鮮紅細(xì)胞能吸附多糖類抗原，但吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力較差。致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3天。為此一般在致敏前先將紅細(xì)胞醛化，可長期保存而不溶血。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。紅細(xì)胞經(jīng)醛化后體積略有增大，兩面突起呈圓盤狀。醛化紅細(xì)胞具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力，血凝反應(yīng)的效果基本上與新鮮紅細(xì)胞相似。如用兩種不同醛類處理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸處理。醛化紅細(xì)胞能耐60℃加熱，并可反復(fù)凍融不破碎，在4℃可保存3～6個(gè)月，在－20℃可保存一年以上。（二）致敏致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。用蛋白質(zhì)致敏紅細(xì)胞的方法有直接法和間接法。直接法只須在低pH，低離子濃度下，用醛化紅細(xì)胞直接吸附即可。間接法則需用偶聯(lián)劑將蛋白質(zhì)結(jié)合到紅細(xì)胞上。常用偶聯(lián)劑為雙偶氮聯(lián)苯胺（bidiazotizedbenzidine，BDB）和氯化鉻。前者通過共價(jià)鍵，后者通過金屬陽離子靜電作用使蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞表面結(jié)合而達(dá)到致敏的目的。（三）血凝試驗(yàn)可在微量滴定板或試管中進(jìn)行，將標(biāo)本倍比稀釋，一般為1：64，同時(shí)設(shè)不含標(biāo)本的稀釋液對照孔。在含稀釋標(biāo)本1滴的板孔（或試管）中，加入0.5％致敏紅細(xì)胞懸液1滴，充分混勻，置室溫1～2小時(shí)，即可觀察結(jié)果。凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈一圓點(diǎn)的為不凝集（一）。如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱（圖13-4），以＋＋凝集的孔為滴度終點(diǎn)。圖13-4血凝反應(yīng)強(qiáng)度示意圖－：紅細(xì)胞沉積于孔底；＋：紅細(xì)胞沉積于孔底，周圍有散在少量凝集；＋＋：紅細(xì)胞形成層凝集，面積較小，邊緣較松散；＋＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略多于＋＋；＋＋＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀三、膠乳凝集試驗(yàn)?zāi)z乳凝集試驗(yàn)也是一種間接凝集試驗(yàn)，所用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8μm大小的圓形顆粒，帶有負(fù)電荷，可物理性吸附蛋白分子，但這種結(jié)合牢固性差。也可制備成具有化學(xué)活性基團(tuán)的顆粒，如帶有羧基的羧化聚苯乙烯膠乳等，抗原或抗體以共價(jià)鍵交聯(lián)在膠乳表面?；瘜W(xué)交聯(lián)一般通過縮合劑碳化二亞胺將膠乳上的羧基與被交聯(lián)物上的氨基縮合在一起。這種用交聯(lián)致敏的膠乳試劑性能穩(wěn)定，保存期長。膠乳凝集試驗(yàn)分試管法與玻片法。試管法先將受檢標(biāo)本在試管中以緩沖液作倍比稀釋，然后加入致敏的膠乳試劑，反應(yīng)后觀察膠乳凝集結(jié)果。玻片法操作簡便，一滴受檢標(biāo)本和一滴致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后，連續(xù)搖動2～3min即可觀察結(jié)果。出現(xiàn)凝集大顆粒的為陽性反應(yīng)，保持均勻乳液狀為陰性反應(yīng)。膠乳為人工合成的載體，因此其性能比生物來源的紅細(xì)胞穩(wěn)定，均一性好。但膠乳與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力以及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此作為間接凝集試驗(yàn)，膠乳試驗(yàn)的敏感度不及血凝試驗(yàn)。四、間接凝集反應(yīng)的作用間接凝集反應(yīng)具有快速、敏感、操作簡便、無需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備等特點(diǎn)，而且能用于抗原或抗體的測定，因此在臨床檢驗(yàn)中廣為應(yīng)用。（一）抗原的檢測反向間接凝集試驗(yàn)可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質(zhì)成分。間接凝集反應(yīng)的敏感度雖較沉淀反應(yīng)高，但低于新發(fā)展的各種標(biāo)記免疫測定。因此在微量抗原測定中其實(shí)用性取決于臨床的要求。例如測定尿液HGG的膠乳凝集妊娠試驗(yàn)，直接凝集法的敏感度約為300mIU/ml，凝集抑制法的敏感度約為1000mIU/ml，停經(jīng)35～40天以上的孕婦可測得陽性結(jié)果。檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的間接血凝試驗(yàn)敏感度一般在2～5ng/ml，對獻(xiàn)血員的篩檢已不符合要求。（二）抗體的檢測可用于檢測細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體，例如間接血凝試驗(yàn)或明膠顆粒凝集試驗(yàn)用于檢測抗人免疫缺陷病毒（HIV）抗體以診斷艾滋病、膠乳凝集試驗(yàn)用于檢測抗溶血素O等。也有用于檢測自身免疫性疾病的抗體，例如類風(fēng)濕因子膠乳凝集試驗(yàn)、抗DNA抗體和抗甲狀腺球蛋白抗體的間接血凝試驗(yàn)等。